沃森和克里克1953年在英國《Nature》雜志上發(fā)表的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，不但為人類認(rèn)識(shí)生命的本質(zhì)，揭示生命現(xiàn)象，打開了一扇大門，而且也為我們后來的臨床分子診斷奠定了基礎(chǔ)。臨床分子診斷系指采用分子生物學(xué)方法（基因擴(kuò)增、測序、雜交、蛋白質(zhì)組分析、代謝組學(xué)分析等）檢測患者體內(nèi)特定遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化而做出的診斷。分子診斷的材料包括D N A、R N A、蛋白質(zhì)和代謝途徑中涉及的小分子。分子診斷發(fā)展到現(xiàn)在，如果說有階段性里程碑的話，從1953年始，幾乎每隔10年左右即有。1963年，桑格的雙脫氧測序方法的發(fā)明，使特定基因的DNA序列不再神秘。美國的雅勞和伯森在研究人類激素時(shí)，發(fā)明了采用放射性核素標(biāo)記的可測量微量激素的放射免疫試驗(yàn)（Radioimmunoassay，RIA）。其后，在相當(dāng)長一段時(shí)間內(nèi)，放射性核素標(biāo)記方法在分子生物學(xué)研究和分子診斷得到了廣泛應(yīng)用。1972-1973年伯格等創(chuàng)建了重組DNA技術(shù)，由其衍生的基因工程，不但大大拓展了分子診斷技術(shù)，而且改變了人類的生活。1983年莫利斯發(fā)明的聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR），在其耐熱DNA聚合酶的瓶頸問題解決后，1989年后，即成為生命科學(xué)研究和分子診斷的“革命性”技術(shù)，并使得人類基因組計(jì)劃得以在1990年開始啟動(dòng)?，F(xiàn)在的涉及DNA和RNA的分子診斷，幾乎離不開PCR及其衍生技術(shù)。1991-1993年實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)使PCR定量變得簡單明了，并大大減少了實(shí)驗(yàn)室“污染”的機(jī)會(huì)。芯片技術(shù)的出現(xiàn)，解決了高通量檢測的問題。2003年人類基因組計(jì)劃的初步完成，進(jìn)入到后基因組時(shí)代，功能基因組學(xué)研究揭示了人類各種基因多態(tài)性與疾病易感及藥物敏感的關(guān)系，并延伸到腫瘤基因組的研究，從基因結(jié)構(gòu)變化及其表達(dá)，得到個(gè)體疾病的預(yù)后和治療藥物的選擇信息，進(jìn)入到個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測時(shí)代。2010年代以后，隨著新一代測序技術(shù)的出現(xiàn)，個(gè)體基因組的分析變得迅捷而又價(jià)廉，是分子診斷領(lǐng)域的又一個(gè)革命性的進(jìn)步。
臨床分子診斷尤其是涉及到基因擴(kuò)增的檢測技術(shù)，要保證檢驗(yàn)質(zhì)量，必須有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理，并標(biāo)準(zhǔn)化，否則，極易出現(xiàn)由實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物或標(biāo)本之間交叉“污染”所致的假陽性結(jié)果，影響臨床疾病的診療。
一、我國的臨床分子診斷應(yīng)用及質(zhì)量管理的回顧
我國乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）人群感染率一直較高，上個(gè)世紀(jì)80年代，在國內(nèi)不少傳染病醫(yī)院或醫(yī)院的傳染科實(shí)驗(yàn)室，即采用同位素（P32）標(biāo)記DNA探針直接膜上斑點(diǎn)雜交的方法檢測HBV DNA。但由于核酸斑點(diǎn)雜交的檢測敏感性較低（105拷貝/ml以上），盡管假陰性結(jié)果存在，但假陽性問題較少發(fā)生。1989年后，隨著PCR技術(shù)的引入，從90年代初到中期，全國大到三級(jí)甲等醫(yī)院，小到鎮(zhèn)一級(jí)的衛(wèi)生院，眾多的實(shí)驗(yàn)室都在開展臨床PCR檢驗(yàn)，全國生產(chǎn)PCR試劑的廠家也有上百家之多。臨床檢測應(yīng)用中出現(xiàn)了大量的假陽性問題，于是，有些臨床實(shí)驗(yàn)室在檢測HBV DNA時(shí)，檢測后，通常是先看乙肝“兩對(duì)半”結(jié)果，相符即報(bào)陽性，不相符報(bào)陰性。一個(gè)性病病原體核酸PCR檢測，出現(xiàn)陽性結(jié)果，則將患者找過來問，有臨床癥狀的，報(bào)陽性，否則，報(bào)陰性。導(dǎo)致了臨床醫(yī)生對(duì)PCR檢驗(yàn)結(jié)果的不信任。其影響之大之深，直到現(xiàn)在，在不同的學(xué)術(shù)場合，乃至一些臨床疾病診療指南內(nèi)，一提到PCR，就會(huì)說其不可靠，假陽性過高。
鑒于上世紀(jì)90年代中期臨床PCR檢驗(yàn)存在的上述問題，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心于1998年3月20日在衛(wèi)生部北京醫(yī)院召開專家座談會(huì)，與會(huì)專家指出了所存在的大量問題，隨后不到一個(gè)月，衛(wèi)生部下發(fā)了《關(guān)于暫停臨床基因擴(kuò)增（PCR）檢驗(yàn)的通知》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[1998]第9號(hào)），暫停了PCR在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用。這種暫停并不意味著PCR技術(shù)本身有什么問題，無疑其是一個(gè)成熟的技術(shù)，問題的存在是因?yàn)閼?yīng)用的不規(guī)范，一則實(shí)驗(yàn)室沒有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)；二是實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員沒有經(jīng)過臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)相關(guān)的質(zhì)量保證方面知識(shí)的培訓(xùn)；三是實(shí)驗(yàn)室沒有建立有效的質(zhì)量保證體系；四是當(dāng)時(shí)的試劑方法多為科研用擴(kuò)增產(chǎn)物初步鑒定所用到的PCR凝膠電泳方法，很不規(guī)范。經(jīng)過充分醞釀和準(zhǔn)備，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心（以下簡稱部中心）于1997年年底，向全國發(fā)出了第一次HBV DNA質(zhì)評(píng)樣本進(jìn)行室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的預(yù)研[1]，1998年正式開展HBV DNA和丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）RNA室間質(zhì)量評(píng)價(jià)項(xiàng)目[1,2]。1999年8月舉辦了第一期《全國臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員培訓(xùn)班》。2002年1月衛(wèi)生部下發(fā)了《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2002〕10號(hào)），要求凡是開展向患者收費(fèi)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的臨床實(shí)驗(yàn)室必須按規(guī)范進(jìn)行設(shè)置，要有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)，配備必要的儀器設(shè)備，人員須接受部中心及其指定機(jī)構(gòu)的培訓(xùn)，持證上崗。同時(shí)，要建立實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證體系，編寫標(biāo)準(zhǔn)操作程序（Standard operation procedure，SOP）。具備上述硬件和軟件后，須通過由部中心或省級(jí)臨床檢驗(yàn)中心組織的專家驗(yàn)收，合格后方可正式開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目。同時(shí)，部中心下發(fā)了《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》（衛(wèi)檢字[2002]9號(hào)）。2002年7月深圳市人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部分子生物室成為第一家通過驗(yàn)收的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室。同年，部中心組織編寫了人員培訓(xùn)教材《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)》[3]，根據(jù)實(shí)際驗(yàn)收發(fā)現(xiàn)的問題及技術(shù)的進(jìn)展，2007年又出版了《實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)》[4]。2010年12月衛(wèi)生部正式下發(fā)了《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)）。截止到2011年10月，全國按照所制定的標(biāo)準(zhǔn)通過驗(yàn)收的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室共1600余家。采用所編寫的培訓(xùn)教材和培訓(xùn)模式共舉辦了培訓(xùn)班150多期，培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員13000多人，涉及全國28個(gè)省、直轄市和自治區(qū)。
為保證臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)病毒核酸定量檢測的量值溯源，部中心自2002年開始研制HBV和HCV核酸檢測國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[5-7]，分別于2005年和2007年獲得國家二級(jí)和一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書。并采用基于MS2噬菌體衣殼蛋白包裝外源RNA的病毒樣顆粒，研制無生物傳染危險(xiǎn)性且穩(wěn)定的RNA病毒核酸質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[8-10]，獲得5種HCV RNA和1種HIV-1 RNA液體國家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
二、現(xiàn)狀及問題
長期以來，我國的臨床分子診斷項(xiàng)目主要在感染性疾病病原體核酸的擴(kuò)增檢測，如HBV、HCV、人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）、結(jié)核分枝桿菌、沙眼衣原體、淋球菌等，所采用的方法基本上都是實(shí)時(shí)熒光PCR，開展的科室主要在醫(yī)療機(jī)構(gòu)的檢驗(yàn)科，個(gè)別在感染科、皮膚科等臨床科室的實(shí)驗(yàn)室。極少部分在遺傳病的產(chǎn)前診斷，如廣東、廣西和海南地區(qū)的地中海貧血的產(chǎn)前基因檢測等，采用的方法主要有PCR瓊脂糖凝膠電泳和PCR雜交（膜上和芯片）等，開展的科室除了檢驗(yàn)科外，相當(dāng)部分在婦幼保健相關(guān)的產(chǎn)前診斷中心的實(shí)驗(yàn)室。已接受培訓(xùn)的人員及通過驗(yàn)收的實(shí)驗(yàn)室基本上也都是這些實(shí)驗(yàn)室。上述實(shí)驗(yàn)室相當(dāng)一部分都經(jīng)過了5-10年的運(yùn)行及持續(xù)改進(jìn)培訓(xùn)（各級(jí)臨床檢驗(yàn)中心定期舉辦的質(zhì)控和持續(xù)改進(jìn)培訓(xùn)班及會(huì)議等），除了有符合分區(qū)要求的實(shí)驗(yàn)室外，基本上都建立了較為完整的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系，有了較好的質(zhì)量意識(shí)，迅速扭轉(zhuǎn)了臨床PCR檢驗(yàn)不可靠的局面。盡管如此，上述實(shí)驗(yàn)室仍有需要注意或改進(jìn)之處，主要在以下幾個(gè)方面，主要是理念問題：
（1）SOP沒有可操作性。這一點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理和標(biāo)準(zhǔn)化的靈魂，如果SOP的編寫不是為實(shí)際工作，只是為了應(yīng)付驗(yàn)收檢查，則質(zhì)量管理和標(biāo)準(zhǔn)化就無從談起。
（2）儀器設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)不到位。對(duì)PCR儀、恒溫干浴儀、生物安全柜、測序儀、雜交儀、芯片掃描儀、加樣器等儀器設(shè)備沒有定期的維護(hù)，或根本不知道怎么維護(hù)。對(duì)加樣器、擴(kuò)增儀等的校準(zhǔn)由外部機(jī)構(gòu)如儀器廠家、計(jì)量部門等進(jìn)行，流于形式，沒有SOP、沒有校準(zhǔn)的原始實(shí)驗(yàn)記錄，并且不清楚儀器設(shè)備的技術(shù)檔案如何建立及其作用。
（3）實(shí)驗(yàn)記錄的形式化及不會(huì)歸檔。
（4）不會(huì)分析室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果，有些沒有商品質(zhì)控品的項(xiàng)目不知道質(zhì)控品從哪來，自然就沒有室內(nèi)質(zhì)控。
（5）有些項(xiàng)目不參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。
（6）人員的內(nèi)部培訓(xùn)形式化，不參加相關(guān)的質(zhì)控會(huì)議，缺乏持續(xù)的外部培訓(xùn)。此外，也有相當(dāng)?shù)娜藛T對(duì)實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、緩沖間、傳遞窗和空氣流向設(shè)計(jì)的必要性和正確性的理解不到位。
隨著新的治療藥物、藥物代謝與特定基因多態(tài)性關(guān)系、藥物作用特定基因的突變等的研究進(jìn)展，以個(gè)體化用藥治療為特征的個(gè)體化醫(yī)學(xué)正快步走向臨床醫(yī)學(xué)的前臺(tái)，個(gè)體化醫(yī)學(xué)能得以實(shí)施的一個(gè)關(guān)鍵性支柱就是以基因及結(jié)構(gòu)變化和基因表達(dá)為檢測靶標(biāo)的個(gè)體化分子檢測，這些檢測除了熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和銀增強(qiáng)原位雜交 （Silver - enhanced in situ hybridization，SISH）檢測乳腺癌HER-2/neu基因擴(kuò)增以及免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry，IHC）檢測HER2受體蛋白表達(dá)狀態(tài)等少數(shù)項(xiàng)目外，基本上都涉及PCR擴(kuò)增，如基于特異熒光探針的實(shí)時(shí)熒光PCR、擴(kuò)增阻滯突變（amplification refractory mutation system，ARMS）實(shí)時(shí)熒光PCR、蝎形（Scorpion）探針ARMS實(shí)時(shí)熒光PCR、PCR測序、PCR芯片或膜或微顆粒（如luminex）上雜交等。相關(guān)研究的進(jìn)展，帶來了“分子病理學(xué)”、“腫瘤基因組學(xué)”、“轉(zhuǎn)錄組學(xué)”和“藥物基因組學(xué)”等概念，最早接觸這些概念者是相關(guān)專業(yè)和臨床科室的一些專家，于是，近年來個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測在全國的許多醫(yī)療機(jī)構(gòu)的病理科、藥劑科、腫瘤科、婦產(chǎn)科、內(nèi)科、甚至胸外科的實(shí)驗(yàn)室開展起來，混亂狀況與上世紀(jì)90年代初中期病原體核酸PCR檢測極為相似，其問題主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：
（1）沒有規(guī)范的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)。大多數(shù)開展此類檢測的實(shí)驗(yàn)室目前處于這樣一個(gè)狀況。
（2）沒有任何的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證體系，不知道臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室須驗(yàn)收合格后，方能開展臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目。
（3）人員沒有經(jīng)過有資質(zhì)機(jī)構(gòu)的規(guī)范化培訓(xùn)，缺乏質(zhì)量意識(shí)。
（4）開展臨床檢測，有的使用商品試劑盒，有的是自配試劑但沒有嚴(yán)格的試劑配制SOP，有的甚至一部分實(shí)驗(yàn)如標(biāo)本制備和基因擴(kuò)增在自己實(shí)驗(yàn)室完成，測序則像研究生做科研一樣，找有關(guān)商業(yè)測序公司進(jìn)行。
（5）沒有室內(nèi)質(zhì)控，或根本不知道如何進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控。
（6）除了極少部分實(shí)驗(yàn)室參加了一些國外公司組織實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果比對(duì)外，基本上沒有定期的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)或?qū)嶒?yàn)室間比對(duì)。
三、展望
一件事情能否成功，離不開“天時(shí)、地利、人和”三個(gè)要素，“人”放在后面，但人是最重要的。沒有高素質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員，一是無法高質(zhì)量的完成常規(guī)檢測操作，二是不可能樹立起真正的質(zhì)量意識(shí)。這里的高素質(zhì)主要指兩個(gè)方面，一是具備較好的專業(yè)知識(shí)技能，其次的也是最重要的，就是做事“認(rèn)真”。有了高素質(zhì)的技術(shù)人員，外部的上崗培訓(xùn)，通俗地講就是一個(gè)“洗腦”過程，更多的是提供一種理念，即通過培訓(xùn)，能明確知道在臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)中，如果不注意把握好一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采取一些有效的措施，所得到結(jié)果就有很大的可能性是錯(cuò)的。但僅有外部的培訓(xùn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，在常規(guī)檢驗(yàn)中，對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部發(fā)生的問題有針對(duì)性的培訓(xùn)和自我完善，與最初的培訓(xùn)的“被動(dòng)學(xué)習(xí)”不同，其源于實(shí)踐高于實(shí)踐，是“主動(dòng)思考”得來的東
西，會(huì)有質(zhì)的飛躍。因此，作為臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在人員具有外部培訓(xùn)合格后，可通過講座、討論、咨詢、練習(xí)、自學(xué)等方式進(jìn)行有效的內(nèi)部培訓(xùn)，培訓(xùn)的記錄可以是書面考試、實(shí)驗(yàn)考核結(jié)果、問題討論心得、問題解決的報(bào)告、針對(duì)日常工作的問題進(jìn)行研究的論文和綜述等。
運(yùn)動(dòng)的物體，速度越快慣性越大。應(yīng)該說，人類的思維很快，所以慣性也最大。從一個(gè)不好的習(xí)慣變成良好的習(xí)慣確實(shí)也很難，但良好的習(xí)慣一旦養(yǎng)成，即成為生產(chǎn)力。臨床實(shí)驗(yàn)室從長期的經(jīng)驗(yàn)管理模式要進(jìn)入到真正的質(zhì)量管理，無疑是需要時(shí)間的，如果是一張白紙，則相對(duì)容易省時(shí)得多，關(guān)鍵是寫的第一筆不能出問題。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有很多是新建的，自然實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員可能也是新進(jìn)人員，如果對(duì)其在一開始就樹立質(zhì)量意識(shí)和理念，加上認(rèn)真的態(tài)度和良好的專業(yè)素質(zhì)，就很容易使實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入到質(zhì)量管理狀態(tài)。當(dāng)然，如果一件事情你持續(xù)不斷地去加強(qiáng)它，它終究會(huì)成為一種習(xí)慣。
有了上面的兩個(gè)基石，余下的就是具體如何去做好的方法問題。做一件事情，沒有一個(gè)好的過程很難得到一個(gè)好的結(jié)果，至少是出現(xiàn)好的結(jié)果的概率極低。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)亦如此。對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)中的“過程”（包括分析前、中和后）的有效掌控，最關(guān)鍵的就是靠SOP的按實(shí)際工作詳細(xì)制訂和日常工作中的切實(shí)遵循。編寫有可操作性SOP的一個(gè)基本原則就是，怎么做怎么寫，注重最可能影響結(jié)果的細(xì)節(jié)。為使實(shí)驗(yàn)室操作者能形象的理解和掌握SOP，可采用文字?jǐn)⑹黾诱掌瑘D示的方法。此外，要指出的是，一個(gè)實(shí)驗(yàn)室剛建立，由于沒有太長的實(shí)際檢驗(yàn)運(yùn)行時(shí)間，有很多的問題沒有想到，因此，編寫的SOP可能就會(huì)有缺陷，這就需要在以后實(shí)際工作中，不斷根據(jù)發(fā)生的問題，對(duì)文件進(jìn)行修改，其根本目的是避免同樣的問題出現(xiàn)第二次，這也是質(zhì)量管理的精髓。整個(gè)檢驗(yàn)過程包括標(biāo)本采集運(yùn)送保存、儀器設(shè)備使用維護(hù)校準(zhǔn)、室內(nèi)質(zhì)控及其分析、室間質(zhì)評(píng)及其分析和結(jié)果報(bào)告與解釋等細(xì)節(jié)，決定于有可操作性的SOP，細(xì)節(jié)決定成敗。
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